1樓：芊雲說電影
脈衝場凝膠電泳-高分子量dna瓊脂糖凝膠塊製備和加工。
1．收集10ml全血，加入30ml細胞裂解液。置冰浴中至少20min直至紅細胞完全溶解。
2．2000r/min離心10min，移去紅色上清液，再次用細胞裂解液洗滌細胞，然後用pbs重懸細胞。
3．稀釋單細胞懸液並取一小份用neubauer腔計數細胞。
4．用pbs重懸細胞，以達到40μl pbs中含1百萬個細胞比例（1百萬個二倍體哺乳動物大約含有基因組dna 10μg）
5．用pbs配製2％濃度低熔點瓊脂糖溶液並保持在50℃。
6．將等體積（各1ml）細胞懸液與瓊脂糖溶液於室溫下混勻，立即倒入凝膠塊模具中。
7．靜置20min讓瓊脂糖固化，用無菌塑料杯（通常用作劃菌）將凝膠塊自模具中取出並置入蛋白酶緩衝液中，加入2mg/ml的蛋白酶k。
8．將帶有凝膠塊的蛋白酶k緩衝液於50℃保持2～3天。每個盛有50ml蛋白酶緩衝液的falcon管可容納多達100個凝膠塊。
9．蛋白酶k消化後，可將凝膠塊保留在此緩衝液或 edta溶液中儲存於4℃。
10． 此外，繼續將凝膠塊用高壓消毒過的te緩衝液沖洗數遍的步驟。
11． 將凝膠塊放入裝有te及 pmsf溶液的falcon試管中，滅活殘留的蛋白酶k。
12． 室溫下用te溶液漂洗凝膠塊數次，將凝膠塊放入另一干淨的試管，可直接用於酶切反應或用。
edta，（儲存凝膠塊。
13． 若用edta儲存凝膠塊，取出後應用te溶液室溫下漂洗30 min×2次。
脈衝場凝膠電泳的凝膠電泳
2樓：網友
1．將的瓊脂糖在中熔化後冷卻至50～60℃，立即注入凝膠框架中，並插入梳子。
2．凝膠固化後小心地拔出齒梳，用2把無菌手術刀將dna凝膠塊上樣。若用不同內切酶消化凝膠塊，則取不同樣品時應將手術刀片燒灼後冷卻。將dna大小標誌物上樣至凝膠的兩旁。
3．用1%液態低熔點瓊脂糖凝膠（配製）密封狹槽。
4．若有氣泡存在，用注射器驅趕氣泡。
5．一旦密封的低熔點瓊脂糖已固化（大約10min），可將凝膠擱入腔室，並用電泳緩衝液覆蓋過膠面。
6．應設定合適的電壓及轉換時間（參考《分子醫學技術》84頁表並開始電泳。兩個不同電泳方向的電流應相等。
7．電泳結束後，凝膠用配製成的eb（染色。
8．用幫浦自槽中排除緩衝液，續以雙蒸水沖洗電泳槽。
9．凝膠成像：dna在**的過程中可能會形成缺口。
10． 用 hcl漂洗凝膠30min，讓dna脫嘌呤，並有利於轉移。
11． 凝膠用鹼（變性溶液中）變性20min，兩次，續以中性溶液1～5min。
12． 採用標準southern印跡方案將dna轉印至尼龍膜上。一般來說，印跡pfge凝膠的時間較普通凝膠印跡時間長（約48h）。
脈衝場凝膠電泳的標準物
3樓：神水盟
1．以te緩衝液懸浮λ多聯體（boehringer ma寶靈曼公司產品），濃度為4μg/40μl。
2．用等體積te配製的2%低熔點瓊脂糖（溫度保持在45℃）混勻。
3．移去混合液注入預冷的凝膠塊模具中。
4．室溫下用te及100 mmol/l nacl溶液溫育2天。 1．從ypd（酵母提取物，蛋白腖和葡萄糖）培養基瓶皿中挑選單一轉殖加入10ml
ypd預培養的肉湯中，30℃下劇烈**生長24小時，然後加入200ml ypd肉湯，劇烈振盪24～48h（產量大約100塊）。
2．4000×g轉速，離心10min，然後用50mmol/l edta/10 mmol/l tris-hcl(溶液懸浮。
3．仍以4000×g轉速離心10min，再用sce[1 mol/l 山梨醇，枸椽酸鈉，及10 mmol/l
edta (溶液重懸。
4．取稀釋後的細胞懸液用neubauer腔計數。
5．溶液短暫離心後，再用sce重懸細胞，使40μl sce溶液中含5×107個細胞（相當於80μl體積的模組中含有5×107個細胞）。
6．溶液與酵母扣糖酶100t和100mmol/lβ-巰基乙醇混勻，37℃保溫15～30min。
7．細胞懸液與等體積的sce配製的2%低熔點瓊脂糖凝膠混勻，保持在50℃。
8．將混合物移注入預冷的凝膠塊模具中。
9．凝膠塊用含10 mmol/l二硫蘇糖醇的sce溶液37℃下振盪溫育1～2小時。
10． 將凝膠塊移入蛋白酶緩衝液中，加入2mg/ml蛋白酶k，50℃溫育48h。
11． 用50 mmol/l edta/10 mmol/l tris-hcl(溶液洗滌凝膠塊3次，每次20min。
12． 凝膠塊可用此混合液於4℃儲存或不用漂洗直接裝載入凝膠中。
請教關於脈衝場凝膠電泳中的一材料（半小時內再追加100）
4樓：網友
呵呵，今天巡視罈子，才看到你的帖子，就是這麼個東西。
脈衝場凝膠電泳能用來進行微生物鑑定嗎？我從土壤中分離了一種細菌，能用該儀器嗎？網上有比對的**嗎？
5樓：網友
你已經得到了這株菌是嗎？
形態，生理生化結合分子生物學鑑定即可。
如果沒有形態分類學基礎，可以直接先做分子鑑定，比對後看大概屬於哪個種後再詳細分析。
分子鑑定步驟：
1.液體培養細菌，一般條件37度24小時即可。
2.菌液pcr。擴增16srdna序列，所用引物網上都有，查到後，將序列傳送生物公司合成。pcr反應條件網上也都有。
3.測序。擴增得到的序列送生物公司測序，ncbi上比對，即可。
跑電泳的時候分子量大的片段跑不開的原因是什麼
6樓：煜淑雅旎
膠解像度不夠 大片段運動時速度很慢，片段之間的距離就拉不開，肉眼也看不清條帶。
對於分子量十分大的片段，可以用脈衝場凝膠電泳。也可以延長電泳時間（此時前面的小分子dna可能會跑出膠外。如果你要的只是大片段，延長電泳時間還是可行的。
畢竟脈衝場凝膠電泳要特殊裝置，麻煩。
瓊脂糖凝膠電泳marker的作用
瓊脂糖凝膠電泳marker的作用是分子標記。dna分子標記具有的優越性有 大多數分子標記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利 基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的 在生物發育的不同階段，不同組織的dna都可用於標記分析 分子標記揭示來自dna的變異 表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性...
凝膠電泳實驗樣品需要加熱嗎急急急
樣品需要加入上樣緩衝液後在100度煮沸10分鐘使蛋白變性後冷卻,12000rpm 10分鐘離心,取上清上樣,不然會堵孔。希望能幫到你 您做的是哪一類凝膠電泳?核酸凝膠電泳不需要加熱。蛋白非變性凝膠電泳一般也不必加熱。蛋白變性凝膠電泳需要煮沸5 10分鐘變性。不同的凝膠電泳需求不同。實驗樣品不需要加熱...
瓊脂糖凝膠電泳分離dna的有效範圍是什麼意思
乙個給定大小的線狀dna分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。dna電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關係。凝膠濃度的選擇取決於 dna分子的大小。分離小於的dna段所需膠濃度是，分離大於kb的dna分子所需膠濃度為，dna段大小間於兩者之間則所需膠濃度為。凝膠電泳技術為什麼能分離dna ...