1樓:南京金益柏生物科技****
50%的緩衝甘油,等體積的甘油+等體積的雙蒸水
細胞免疫熒光怎麼封片
2樓:匿名使用者
細胞bai
免疫熒光的詳細操作du步驟 1,取出細胞爬片zhi放到35mm或60mm用過的細dao胞培養皿裡,pbs洗三遍。注回意有的時候答作的細胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心。 2,4%多聚甲醛固定20分鐘,pbs洗三遍。
3,0.2%triton x 100通透10分鐘,pbs洗三遍。 4, 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,pbs洗三遍。
5.,一抗4度溼盒內過夜,也可37度2小時,感覺前者效果好,pbs洗三遍。 6,二抗室溫2小時,或者37度1半小時,pbs洗三遍。
7,最好用dapi染核,然後直接照熒光片。 8,蒸餾水洗掉pbs,甘油封片,指甲油封**的四周。
求助:免疫熒光染色用什麼封片
3樓:南京金益柏生物科技****
你可以用甘油封片(甘油:pbs=1:1),然後與和樹膠封片一樣,但要注意擦乾周圍,熒光顯微鏡觀察。
細胞爬片做免疫熒光用什麼封片
4樓:南京金益柏生物科技****
甘油不會凝固
bai,**不易長時
du間保
zhi存。指甲油、樹脂對熒光dao有影響,而且指內甲油所含有容機溶劑對物鏡不好。最好用專門的熒光封片劑。
aqua-poly/mount (polysciences, inc.) #18606 20ml $37.65
*histotec permanent aqueous mountant(serotec,immunological excelence)
(his002b)30ml $89
這兩個是現成的,買來就可以用,但**較貴。
sigma mowiol 4-88 是顆粒,需自己配製,量大,**很便宜。
免疫熒光的方法有什麼注意環節
5樓:南京金益柏生物科技****
1、冰凍切片製備:建議用新鮮組織,否則組織細胞內部結構破壞,易使抗原彌散。選用乾淨鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定:切好片風乾後立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min,尤其要較長時間儲存的白片,一定要及時固定和適當儲存。
3、血清封閉:為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗**一致)封閉,減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的,一般 10-30 min。
5、二抗孵育條件:二抗一般室溫或 37°C 立即觀察,若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4°C 30 min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下,然後去摸索一抗濃度和孵育時間。
最後,熒光素標記的二抗隨著儲存時間的延長,可能後有大量的遊離熒光素殘留,需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。
6、復染:目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 dapi 復染。
7、封片:為了長期儲存,我們一般用緩衝甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然後一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發現液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當地加強清洗(延長時間和增多次數)尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是 3 min*3 次,而一抗孵育後的清洗均為 5 次*5 min。注意:
單獨沖洗,防止交叉反應造成汙染。溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;沖洗的時間要足夠,才能徹底洗去結合的物質。
pbs 的 ph 和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓,當時我買的抗體稀釋液偏酸,結果背景一片黃(未見特異性染色),建議 ph 在 7.4-7.
6 濃度是 0.01 m。(中性及弱鹼性條件(ph7-8)有利於免疫複合物的形成,而酸性條件則有利於分解;低離子強度有利於免疫複合物的形成,而高離子強度則有利於分解)
9、拍照:有條件的話最好立即拍照,若不能及時拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和溼度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作,不要隨意改變程式;應在暗室中進行檢查;防止紫外線對眼睛的損害,在調整光源時應戴上防護眼鏡;檢查時間每次以1~2 h 為宜,超過 90 min,超高壓汞燈發光強度逐漸下降,熒光減弱;標本受紫外線照射 3~5 min 後,熒光也明顯減弱或褪色;激發光長時間的照射,會發生熒光的衰減和淬滅現象;所以最多不得超過 2~3 h;熒光顯微鏡光源壽命有限,標本應集中檢查,以節省時間,保護光源。
天熱時,應加電扇散熱降溫,新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時,須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。
關閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘後;標本染色後立即觀察,因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4°C 儲存,可延緩熒光減弱時間,防止封裱劑蒸發;使用的玻片等載體,都必須厚度均勻,無明顯的自發熒光,如果使用油鏡,還必須保證鏡油為無熒光鏡油;電源最好裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果。
求助 細胞免疫熒光的詳細操作步驟
6樓:匿名使用者
1,取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養皿裡,pbs洗三遍。注意有的時候作的細胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心。
2,4%多聚甲醛固定20分鐘,pbs洗三遍。
3,0.2%triton x 100通透10分鐘,pbs洗三遍。
4, 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,pbs洗三遍。
5.,一抗4度溼盒內過夜,也可37度2小時,感覺前者效果好,pbs洗三遍。
6,二抗室溫2小時,或者37度1半小時,pbs洗三遍。
7,最好用dapi染核,然後直接照熒光片。
8,蒸餾水洗掉pbs,甘油封片,指甲油封**的四周。
繼續求助免疫熒光檢測,繼續求助免疫熒光檢測NF
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