1樓:匿名使用者
酶活性測定的原理:e5a48de588b662616964757a686964616f31333361326366
超氧物歧化酶(superoxide di**utase,sod)
活性的測定 sod採用氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium,nbt)法(beauchamp和fridovich,1971)。反應步驟為:取200μl粗提液,加入3.
7 ml nbt反應液50mmol/lph7.8的磷酸緩衝液(pbs)配製的含77.12μmol/l氮藍四唑, 100μmol/ledta-na2和13.
37mmol/l甲硫氨酸溶液〕,在30°C下保溫2分鐘後加入100μl核黃素溶液(ph7.8的50mmol/l磷酸緩衝液中含80.2μmol/l 核黃素和100μmol/ledta-na2),在4000lx日光下反應20min。
然後迅速測定a560。以不照光的管做空白。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μl。
酶活性按以下公式計算:以抑制nbt光化還原的50%為一個sod活性單位,結果以u/mg蛋白表示。以加緩衝液代替酶液的作為對照。
sod總活性=(ack-ae)×v/(ack×0.5×w×vt) 式中, ack為照光對照管的吸光度;ae為樣品管的吸光度;v為樣品液總體積(ml);vt為測定時樣品用量(ml);w為樣品鮮重(g)或蛋白質含量(mg)。
過氧化氫酶(catalase,cat)
活性測定 cat 活性參照aebi (1984)[7]的方法進行測定。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μl 。400 μl反應液含50 mmol/l的pbs (ph 7.
0),30 mmol/l的h2o2和50 μl粗酶液。反應從加入過氧化氫開始計時,連續測定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定義為:
一個過氧化氫酶單位相當於在規定條件下於溫度25°C,ph7.0條件下1分鐘分解1μmol過氧化氫所需酶量,結果以u/mg蛋白或u/g鮮重表示。
多酚氧化酶(polyphenoloxidase,ppo)
活性的測定 ppo活性測定採用鄰苯二酚法(aquino-bolaños和mercado-silva,2004)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μl。350μl反應液(用50mmol/l,ph6.
4的pbs配製,內含100μmol/l鄰苯二酚)中加入50 μl的粗酶液,平衡1分鐘後連續測定398nm吸光度的變化。以1分鐘內398nm吸光度上升0.01為一個酶活性單位,結果以u/mg蛋白或u/g鮮重表示。
過氧化物酶(peroxidase,pod)
活性測定pod活性測定採用愈創木酚法(lurie等,1997)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μl。反應體系為30μl粗酶液,290 μl 0.
3%愈創木酚(用50 mmol/l的pbs配製,ph 6.4)和 80μl0.3%h2o2(用50 mmol/l的pbs配製,ph 6.
4)。反應在加入h2o2 後開始準確記時。連續吸光度在470 nm的上升值。
酶活性以每分鐘上升0.01為一個單位,結果以u/mg蛋白或u/g鮮重表示。
酶活力的常用測定方法?
2樓:春素小皙化妝品
常用的測定方法有取樣法和連續法。
1、取樣法
在酶反應開始後不同的時間,從反應系統中取出一定量的反應液,並用適當方法停止其反應,再根據產物和底物在化學性質上的差別進行分析,求得單位時間內酶促反應的變化量。
2、連續法
基於底物和產物在物理化學性質上的不同,在反應過程中對反應系統新增酶的變性劑以終止反應,常用的連續測定法是光吸收測定法,即根據產物和底物在某一波長或波段上有明顯的特徵吸收差別而建立起來的連續觀測方法,幾乎所有的氧化還原酶都可用此法測定。
此外如熒光法、旋光法、電化學法也是常用的連續測定方法。對不易直接測定的反應,可使用酶偶聯分析法,即用過量、專一的「偶聯工具酶」,使被測反應繼續進行到某一可直接測定的階段。近年來,酶活性的測定工作正向兩個方向發展,超微量酶活的靈敏測定,實現測定過程的自動化控制。
擴充套件資料
酶活力的大小可以用在一定條件下,它所催化的某一化學反應的轉化速率來表示,即酶催化的轉化速率越快,酶的活力就越高;反之,速率越慢,酶的活力就越低。所以,測定酶的活力就是測定酶促轉化速率。酶轉化速率可以用單位時間內單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。
酶活力的測定既可以通過定量測定酶反應的產物或底物數量隨反應時間的變化,也可以通過定量測定酶反應底物中某一性質的變化,如黏度變化來測定。通常是在酶的最適ph 值和離子強度以及指定的溫度下測定酶活力。
3樓:學子莘
酶活力的測定方法:有兩種主要方法
即終止反應法和連續反應法。
終止反應法:是在恆溫反應系統中,每隔一定時間,取出一定體積的反應液,用強酸強鹼或sds以及加熱等使反應立即停止,然後用化學法放射性化學法或酶偶聯法分析產物的形成量或底物的消耗量。這是最經典的酶活力測定方法,幾乎所有的酶都可以根據這一原理設計出具體的測定方法。
連續反應法:無須終止反應,而是在酶反應過程中用光化學儀器或電化學儀器等來監測反應的進**況,對記錄結果進行分析,然後計算出酶活力。
血清酶活性測定的方法主要有哪些
4樓:du知道君
1.反應速度 大多數酶促反應是可逆反應,其速度既受底物濃度的影響,也受產物生成量的影響。當底物濃度較高時,在反應的初期,其濃度變化甚微,產物生成量也很少,此時反應速度可看作是恆定的。
酶反應動力學中所指速度就是反應的初速度。 2.底物濃度 米氏方程ν=νmax【s】/km+【s】是反映酶促反應速度與底物濃度關係的方程式,其中km稱米氏常數。
km值是酶的特徵常數之一,只與酶的性質有關,而與酶濃度無關。不同的酶,km值不同。同一個酶有幾種底物時,則對每一種底物各有一特定的km值,其中km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。
綜上所述,根據酶的特性及定量原理,測定酶活力時,必須注意以下幾點: (1)酶促反應過程中,只有最初一段時間內反應速度與酶濃度成正比,隨著反應時間的延長,反應速度即逐漸降低。 (2)要規定一定的反應條件,如時間、溫度、ph等,並在酶測定過程中保持這些反應條件的恆定,如溫度不得超過規定溫度的士1°C,ph應恆定。
(3)配製的底物濃度應準確且足夠大,底物液中應加入不抑制該酶活力的防腐劑並儲存於冰箱中,以防止底物被分解。 (4)標本要新鮮,由於絕大多數酶可因久置而活力降低,標本如無法及時測定,應儲存於冰箱中。用血漿時,應考慮到抗凝劑對酶反應的影響。
有些酶在血細胞、血小板中的濃度比血清高,為此在採血、分離血清時,應注意防止溶血和白細胞的破裂。 (5)在測定過程中,所用儀器應絕對清潔,不應含有酶的抑制物,如酸、鹼、蛋白沉澱劑等。
測定酶活性的條件是什麼
5樓:胡道增
我國檢驗學會檔案中對最適條件是這樣提出:1選合適的底物、輔因子、活化劑、變構劑的種類和濃度。2指示酶和輔助酶的種類和濃度。
3反應混合液的最適ph,緩衝液種類和濃度。4其它影響酶活性的因素,如去除各種抑制劑。並提出:
在某些情況下,為了獲得更好的測定重複性或更大的臨床價值,可考慮對上述「最適條件」作適度的修改。
6樓:匿名使用者
各種酶有各自最佳的酶活性溫度和ph等,不能一概而論。
酶活性可根據米氏方程測定若干個點,做出1/v與1/s圖,然後找出相應濃度下的酶活即可。
7樓:匿名使用者
酶活性用km值表示,做出1/v與1/s圖即可
請問dna聚合酶活性的測定方法是什麼?
8樓:匿名使用者
tag:酶
活性的測定方法 酶活性測定 硝酸還原酶活性測定 dna聚合酶 taq dna聚合酶 dna測定 dna濃度的測定 dna聚合酶的結構 dna定量測定 hbv dna測定值
買二抗的時候發現,有些抗igg的抗體還有分特異抗重鏈或者輕鏈,但是一般做二抗的好像沒有分。請問各位大俠,這些有特異性的抗體能做二抗麼?其結果跟一般的二抗有區別麼?
抗igg是有三種二抗抗體:whole igg,抗輕鏈的針對f(ab』)2/fab片段的igg,抗重鏈的針對fc片段的igg。
其中whole igg是完整的抗體分子,有一個fc部分和兩個與抗原結合的fab部分,適 ...
9樓:過往再見
dna聚合酶作用於
單個的脫氧核苷酸的磷酸二酯鍵
,而dna連線酶作用於dn**段間的磷酸二酯鍵。
1、dna連線酶:
dna連線酶也稱dna黏合酶,在分子生物學中扮演一個既特殊又關鍵的角色,那就是把兩條dna黏合成一條。無論是雙股或是單股dna的黏合,dna黏合酶都可以藉由形成磷酸雙脂鍵將dna在3'端的尾端與5'端的前端連在一起。雖然在細胞內也有其他的蛋白質,例如像是dna聚合酶在其中一股dna為模版的情況下,將另一邊的dna單股斷裂端,通過聚合反應的過程形成磷酸雙脂鍵(phosphodiester bond)來黏合dna(dna連線酶將dn**段縫合起來,恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸雙脂鍵)。
但是dna聚合酶的黏合過程卻只是聚合反應一個附帶的功能而已,真正在細胞內扮演dna黏合反應的工作還是以dna黏合酶為主。dna黏合酶的功能便是黏合斷裂的dna,而細胞內只有dna複製與dna修復的反應牽涉到dna斷裂的合成,因此dna黏合酶就是在上述的兩個機制扮演重要的角色。除了細胞內的黏合反應,隨著分子生物學的進展,幾乎大多數的分子生物實驗室都會利用dna黏合酶來進行重組dna的實驗,或許這也可以被規類為其另一種重要的功能。
2、dna聚合酶
dna聚合酶(dna polymerase)是細胞複製dna的重要作用酶。dna聚合酶 , 以dna為複製模板,從將dna由5'端點開始複製到3'端的酶。dna聚合酶的主要活性是催化dna的合成(在具備模板、引物、dntp等的情況下)及其相輔的活性。
真核細胞有5種dna聚合酶,分別為dna聚合酶α(定位於胞核,參與複製引發,不具5'-3'外切酶活性),β(定位於核內,參與修復,不具5'-3'外切酶活性),γ(定位於線粒體,參與線粒體複製,不具5'-3',有3'-5'外切活性),δ(定位核,參與複製,具有3'-5',不具5'-3'外切活性),ε(定位於核,參與損傷修復,具有3'-5',不具5'-3'外切活性)。
原核細胞:在大腸桿菌中,到目前為止已發現有5種dna聚合酶,分別為dna聚合酶i、ii、iii、iv和v,都與dna鏈的延長有關。dna聚合酶i是單鏈多肽,可催化單鏈或雙鏈dna 的延長,於2023年發現;dna聚合酶ii則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關;dna聚合酶iii在細胞中存在的數目不多,是促進dna鏈延長的主要酶。
dna聚合酶iv和v直到2023年才被發現。
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