1樓:匿名使用者
殊的功能。在各種疾病期間總血清蛋白濃度和各蛋白質組分的比例可發生變化,因此,血清蛋白質和各蛋白質組分的定量在臨床診斷和**上有很重的價值[1]。「血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳」實驗因而是《生物化學》學科實驗專案中最常開設的基本實驗專案之一,該實驗的開設有利於幫助學生更進一步瞭解血清蛋白質的基本組分及正常含量。
但是,電泳分析由於手工比重較大,技術人員的經驗和手法、電泳溫度和時間、緩衝液離子度的改變、電泳薄膜的脫色及透明等諸多因素直接影響分析結果的準確性和重複性[2]。要使血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗順利成功,就必須重視實驗的各個環節,尤其在實驗儀器、實驗藥品和載體、實驗準備、學生操作等主要環節。經過多年反覆實踐,筆者認為「血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳」實驗要取得成功應注意以下四個主要環節。
1.實驗儀器方面應注意:
1.1電泳儀和電泳槽 北京六一儀器廠生產的dyy-iii8a穩壓穩流定時電泳儀、電泳槽。每次試驗開始或結束要注意將電泳儀的各個調節樞紐調至零點位置,電泳槽要用水洗淨再用蒸餾水沖洗涼幹,保護鉑金絲,使之不被腐蝕。
1.2分析天平 上海天平儀器廠出產的tg328b分析天平。使用前進行除錯,保證測定結果正確。
1.3分光光度儀 上海第三分析儀器廠製造的721分光光度計。使用前進行除錯,保證稱量數量準確。
2.實驗藥品和載體方面應注意:
2.1實驗藥品 用於配製緩衝液及染色液所用的藥品,儘可能選擇正規廠家生產的藥品,試劑等級要求在ar或以上,而且要求配製緩衝液所需的巴比妥和巴比妥鈉,兩種藥品儘可能為同一廠家生產,並注意有效期。
2.2載體 由於載體成分及做工不同,對血清蛋白吸附、分離等能力不同會造成電泳結果的差異[3]。因此,血清蛋白電泳所選用的載體-醋酸纖維素薄膜(我們選用浙江黃岩四青生化材料廠出品)的質量要求應該是質細、孔細、吸水性強、染料吸附量少、蛋白區帶分離鮮明、對蛋白染色穩定者為佳。
3.試驗準備時需注意:
3.1試劑準備 配製緩衝液的藥品(巴比妥緩衝液-巴比妥/巴比妥鈉,ph8.6、離子強度0.
06)要求用分析天平稱量,最好精確到0.001g。配製的緩衝液離子強度偏小易導致區帶拖尾;若緩衝液離子強度偏大易導致區帶過密。
配製染色液的藥品(氨基黑10b)也用分析天平稱量,最好精確到0.01g。其它試劑可按照常規配製。
3.2電泳儀和電泳槽準備及電極的連線
3.2.1電泳儀的準備 首先檢查電泳儀功能狀態,將各個調節樞紐調至零點位置,使指標復位。
3.2.2電泳槽準備的準備 首先要用水洗淨電泳槽,再用蒸餾水沖洗電泳槽後涼幹,把洗淨並摺疊好的四層幹沙布放在裝有緩衝液的玻璃槽中浸泡,再置於電泳槽中的支架上搭橋,然後向兩邊的電泳槽中加入等體積的緩衝液至刻度線水平。
3.2.3電極的連線 最初兩次電泳可按照「正常連線方式」將電泳儀上的電極連線於電泳槽的電極上。
如果連續多次電泳則需要「調換電極連線方式」才能獲得理想的電泳效果,否則要求更換電泳槽中的緩衝液。
4.學生操作時必須注意:
實驗過程中正確指導學生操作是做好本試驗的主要環節,必須加強對學生在準備、點樣、電泳、通電、染色和漂洗、定量等步驟的指導,持別是在「點樣」這一步驟。
4.1準備 將醋酸纖維素薄膜切割成2×8cm的矩形小孩子條,在其粗糙面的一端1.5cm處,用鉛筆輕劃一橫線作為「加樣位置」的記號,可以按照每位同學的學號進行編號,然後置於裝有緩衝液的玻璃槽中浸泡並不斷搖動5~10分鐘,待薄膜充分浸透後,即膜條無白斑時,用攝子取出,夾於潔淨的濾紙中間吸去多餘的緩衝液。
注意不能吸得太乾以避免影響導電,點樣薄膜過幹,導致電泳圖譜有條痕,亦不能留存過多緩衝液以避免點樣時血清隨著緩衝液而擴散開來。
4.2點樣 掌握好點樣技術是獲得清晰電泳圖譜的最重要環節。先取少量血清置於玻璃板上,用點樣器(蓋鋁片製作)的鋼口蘸取血清,然後將鋼口平值「印」於點樣線上(不可用力過大以避免弄破薄膜),待血清滲入薄膜後移開點樣器。
注意觀查血清是否均勻地分佈在點樣線上,若有血清擴散或血清分佈不均勻則廢棄,重新選用另外一張準備好(指已浸泡透)的備用薄膜點樣。
必須注意的是:點樣時血清分佈不均勻易導致電泳圖譜不齊;點樣時血清加樣量過多易導致電泳圖譜分離不良或中間顏色變淺;點樣時血清加樣量過少可導致電泳圖譜染色過淺。這些因素會影響蛋白電泳的結果分析。
因此,在實驗操作時應指導學生掌握好加樣量,以避免造成定量測定時產生結果誤差。
4.3電泳 將已點樣的薄膜端靠近陰極,粗糙面(即點樣面)向下(防蒸乾影響導電)平整地緊貼於電泳槽支架的「沙布橋」上。蓋上蓋子,平衡5分鐘後通電。
注意,電泳槽密閉不嚴,薄膜易蒸乾,導致電泳圖譜有條痕。
4.4通電 一般用電壓130~160v,若用電流則按照0.4~0.6毫安/釐米進
行換算。夏季通電40~50分鐘,冬季通電60分鐘左右。待電泳區帶約3.
5釐米時,將調節樞紐調至零點位置,然後切斷電源。如出現電滲現象可增大電流量克服。但是,電流過大易導致電泳圖譜有條痕。
4.5染色漂洗 小心從電泳槽中取出薄膜,直接浸於裝置染色液的玻璃槽中,並輕輕不斷搖動5分鐘,待能看清楚藍色的電泳區帶後,取出並用漂洗液連續漂洗,直至薄膜底色漂淨為止。即得五條蛋白色帶。
從遠離點樣端起依次為清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白。應注意的是染色時間不足夠易導致染色後清蛋白中間顏色變淺。
4.6定量 將漂淨的薄膜用濾紙吸乾,由蛋白質區帶分段剪下,分別浸入裝有0.4mol/lnaoh溶液的試管中,清蛋白管用4ml,其餘各管為2ml。
振搖數次,約25分鐘,藍色即可完全浸出。用721分光光度計於580~620nm波長進行比色,蒸餾水調零,讀取各管吸光度數,計算出白蛋白和各種球蛋白所佔百分比。
4.7透明 如果需要儲存電泳結果,可按照下列方法將薄膜透明:將染色、漂洗、乾燥後(可用乾燥箱乾燥)的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜置於透明液中浸泡1~3分鐘後取出,貼於玻璃板上,不要存在氣泡。
約2~3分鐘薄膜便可完全透明,待幹後撕下壓平整,可供長期儲存和直接用於光密度計掃描分析。
血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的實驗分析怎樣寫?
2樓:匿名使用者
可以依照以下幾個bai線索du分析:
1,薄膜本身的zhi質量問題(塗層dao不均勻等),專2,點樣技術問題屬,
3,電壓電流控制問題,
4,樣品本身是否有降解、汙染;
5,實驗過程其他可能影響結果的問題,如平衡時間、浸泡時間、染脫色透明時間等。。
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