1樓:匿名使用者
二代測抄序:將基因組dna打碎襲
成約100-200個鹼基的小片段,在片段的兩個末端加上接頭 ( adapter )。將dn**段變成單鏈後通過接頭與晶片表面的引物鹼基互補而使一端被固定在晶片上。另外一端隨機和附近的另外一個引物互補,也被固定住,形成橋狀結構。
通過30輪擴增反應,每個單分子被擴增大約1000 倍,成為單克隆的dna簇,隨後將dna 簇線性化。在下一步合成反應中,加入改造過的dna聚合酶和帶有4種熒游標記的dntp。在dna合成時,每一個核苷酸加到引物末端時都會釋放出焦磷酸鹽,激發生物發光蛋白髮出熒光。
用鐳射掃描反應板表面,在讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類後,將這些熒光基團化學切割,恢復3』端黏性,隨後新增第二個核苷酸。如此重複直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣,統計每輪收集到的熒光訊號結果, 就可以得知每個模板dn**段的序列。
(中源-協-和-基-因)
常見二代測序的3種測序方式的共同點有哪些
2樓:植物網
「普通的基因測序
」應該是指「常規dna測序」吧,是用sanger法(也就是雙脫氧法版)進行測序的方法,權目前非常普遍的是直接用abi 3730xl 進行的自動測序,基本上可以做到600bp-800bp的讀長。
高通量測序的概念其實是一個相對的概念,在2023年的時候,3700、megabace等儀器上的測序也是高通量測序,是相對手工測序或者跑平板膠來說的。
不過到2023年以後,高通量測序就改指第二代測序(next generation sequencing),454、solexa(後改為illumina)和solid等第二代測序,比3730等第一代測序的通量提高了成千上萬倍,甚至上億倍,所以稱為高通量測序。
ngs的特點主要有:
1、通量高。一個run能產生500mb-600gb的資料量。
2、讀長相對較短。454(約400-500bp),llumina(100-250bp),solid(75-100)。
3、單位資料的成本非常低。現在很多專案測序的費用。已經非常低。生物資訊分析成本變得更為重要了。
第二代dna測序技術的操作流程
3樓:咪浠w眯兮
操作流程如下:
1、測序文庫的構建
首先準備基因組,然後將dna隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段,並在兩頭加上特定的接頭。如果是轉錄組測序,則文庫的構建要相對麻煩些,rn**段化之後需反轉成cdna,然後加上接頭,或者先將rna反轉成cdna,然後再片段化並加上接頭。
2、錨定橋接
solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行,flow cell又被細分成8個lane,每個lane的內表面有無數的被固定的單連結頭。上述步驟得到的帶接頭的dna 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構,以供後續的預擴增使用。
3、預擴增
新增未標記的dntp 和普通taq 酶進行固相橋式pcr 擴增,單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性,釋放出互補的單鏈,錨定到附近的固相表面。通過不斷迴圈,將會在flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分佈的雙鏈待測片段。
4、單鹼基延伸測序
在測序的flow cell中加入四種熒游標記的dntp 、dna聚合酶以及接頭引物進行擴增,在每一個測序簇延伸互補鏈時,每加入一個被熒游標記的dntp就能釋放出相對應的熒光,測序儀通過捕獲熒光訊號,並通過計算機軟體將光訊號轉化為測序峰,從而獲得待測片段的序列資訊。
5、資料分析
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分,但是隻有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始資料是長度只有幾十個鹼基的序列,要通過生物資訊學工具將這些短的序列組裝成長的contigs甚至是整個基因組的框架,或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上,並進一步分析得到有生物學意義的結果。
illumina/solexa genome analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在sanger等測序方法的基礎上,通過技術創新,用不同顏色的熒游標記四種不同的dntp,當dna聚合酶合成互補鏈時,每新增一種dntp就會釋放出不同的熒光,根據捕捉的熒光訊號並經過特定的計算機軟體處理,從而獲得待測dna的序列資訊。
4樓:kyoya六
1)測序文庫的構建(library construction)
首先準備基因組(雖然測序公司要求樣品量要達到200ng,但是gnome analyzer系統所需的樣品量可低至100ng,能應用在很多樣品有限的實驗中),然後將dna隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段,並在兩頭加上特定的接頭(adaptor)。如果是轉錄組測序,則文庫的構建要相對麻煩些,rn**段化之後需反轉成cdna,然後加上接頭,或者先將rna反轉成cdna,然後再片段化並加上接頭。片段的大小(insert size)對於後面的資料分析有影響,可根據需要來選擇。
對於基因組測序來說,通常會選擇幾種不同的insert size,以便在組裝(assembly)的時候獲得更多的資訊。
2)錨定橋接(su***ce attachment and bridge amplification)
solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行,flow cell又被細分成8個lane,每個lane的內表面有無數的被固定的單連結頭。上述步驟得到的帶接頭的dna 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構,以供後續的預擴增使用。
3)預擴增(denaturation and ***plete amplification)
新增未標記的dntp 和普通taq 酶進行固相橋式pcr 擴增,單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性,釋放出互補的單鏈,錨定到附近的固相表面。通過不斷迴圈,將會在flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分佈的雙鏈待測片段。
4)單鹼基延伸測序(single base extension and sequencing)
在測序的flow cell中加入四種熒游標記的dntp 、dna聚合酶以及接頭引物進行擴增,在每一個測序簇延伸互補鏈時,每加入一個被熒游標記的dntp就能釋放出相對應的熒光,測序儀通過捕獲熒光訊號,並通過計算機軟體將光訊號轉化為測序峰,從而獲得待測片段的序列資訊。從熒光訊號獲取待測片段的序列資訊的過程叫做base calling,illumina公司base calling所用的軟體是illumina』s genome analyzer sequencing control software and pipeline analysis software。讀長會受到多個引起訊號衰減的因素所影響,如熒游標記的不完全切割。
隨著讀長的增加,錯誤率也會隨之上升。
5)資料分析(data analyzing)
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分,但是隻有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始資料是長度只有幾十個鹼基的序列,要通過生物資訊學工具將這些短的序列組裝成長的contigs甚至是整個基因組的框架,或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上,並進一步分析得到有生物學意義的結果。
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